TEST DI CITOGENETICA MOLECOLARE

La tecnica FISH (Fluorescence In Situ Hybridisation) permette di rilevare sequenze di DNA su cromosomi in metafase o su nuclei interfasici di preparati citogenetici, in coltura o non coltivati. La tecnica prevede l’utilizzo di sonde di DNA in grado di ibridare con l’intero cromosoma o con singole sequenze, e costituisce un potente strumento in aggiunta alle classiche tecniche citogenetiche.

La tecnica FISH applicata a nuclei interfasici è un approccio che trova utilizzo sopratutto nell’indagine rapida delle principali aneuploidie fetali.
La velocità e la precisione dell’ibridazione in situ fluorescente, unite alla crescente disponibilità di sonde specifiche, rendono lo studio delle anomalie cromosomiche più semplice, e con una risoluzione di gran lunga superiore rispetto a quanto potrebbe oggi evidenziare una indagine citogenetica basata solamente sul bandeggio cromosomico, rilevandone la presenza anche di porzioni molto contenute di DNA (alcune centinaia di basi).

Di seguito, vengono riportate le principali applicazioni FISH in uso:

• FISH per Sindrome di Prader willi /Angelman (15q11-13)
• FISH per Sindrome di Cri-du-chat (5p15.2)
• FISH per Sindrome di Di George/VCF(22q11.2)
• FISH per Sindrome di Kallmann (Xp22.3)
• FISH per Sindrome di Miller Dieker (17p13.3)
• FISH per microdelezione SRY (Yp11.31)
• FISH per microdelezione SHOX (Xp22)
• FISH per Sindrome di Smith-Magenis (17p11.21)
• FISH per Sindrome di Williams (7q11.23)
• FISH per Sindrome di Wolf-Hirschhorn (4p16.3)
• FISH con sonde painting (intero cromosoma)
• FISH con sonde subtelomeriche
• FISH oncologiche

Una delle ultime tecnologie in uso presso la nostra struttura è l’Array CGH (Comparative Genomic Hybridization).
Il CGH Array, definito anche Cariotipo Molecolare, è una tecnica capace di identificare aneuploidie cromosomiche (variazioni nel normale assetto numerico dei cromosomi) o variazioni del contenuto di piccole porzioni cromosomiche, come duplicazioni/inserzioni (presenza di copie in eccesso di DNA) o delezioni (perdita di piccole porzioni di DNA).

Il CGH Array è basato su un’analisi comparativa del DNA in esame con un DNA genomico di riferimento di un soggetto sano. Entrambi i campioni (quello da analizzare e quello di riferimento) sono marcati con delle molecole fluorescenti (fluorocromo rosso per il DNA da analizzare e fluorocromo verde per il DNA di riferimento); successivamente vengono uniti e fatti incubare (ibridazione) su un vetrino particolare (array) la cui superfice è ricoperta da frammento di DNA (le sonde). Ognuna di queste sonde rappresenta un frammento del DNA umano, fino a ricostruire l’intero assetto cromosomico.
Il numero delle sonde riportate sul vetrino determina la risoluzione del vetrino: tanto maggiore saranno il numero di sonde, tanto maggiore sarà la risoluzione e, di conseguenza, la possibilità di individuare anche piccole variazioni nel numero di copie di DNA.